| Western Blotting |
| 来源： 发布日期：2024-05-23 人气：140 |
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简介（INTRODUCTION）
蛋白质印迹是一种分析技术，用于检测组织匀浆或提取物中给定样品中的特定蛋白质。 它使用凝胶电泳通过多肽的长度（变性条件）或蛋白质的3-D结构（天然/非变性条件）分离天然或变性的蛋白质 。这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体（NC、PVDF膜），并以特异性抗体作为探针检测。抗体与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异性蛋白进行定性、分析。 材料（MATERIALS） 试剂（REAGENTS） 20% Tween20、10 mM PMSF、0.2 M NaH2PO4、0.2 M Na2HPO4 、TBST、转移膜、化学发光试剂、转移缓冲液（TB buffer）、电泳缓冲液（EB buffer）、PBS 缓冲液、10×丽春红染液、封闭液（5% 脱脂牛奶）、滤纸、SDS-PAGE及其上样缓冲液 器械（EQUIPMENT） 垂直板电泳转移装置、高速离心机、分光光度计、脱色摇床、搪瓷盘、蛋白电泳装置、匀浆器 实验步骤（PROCEDURE） 1. 蛋白样品制备：预计时长：1 h 1) 贴壁细胞总蛋白的提取： A. 按1 mL裂解液加10 μL PMSF（100 mM）混匀后置于冰上。 B. 吸去细胞培养基，用4 °C预冷的PBS洗两次后，根据细胞数目加入相应体积的裂解液摇匀于冰上裂解30 min（60 mm 皿加 1 mL）期间可摇动混匀。 C. 裂解完成后，用枪头将细胞刮掉然后转移到1.5 mL EP管中。 D. 2~3步也可为：加入裂解液静置两分钟后刮下细胞，转移到1.5 mL EP管中，用超声破碎细胞。 E. 12000 g×5 min 4 °C离心后，转移至新的EP管中。 F. - 20 °C保存或进行下一步。 2) 悬浮细胞总蛋白的提取 A. 将培养基倒至15 mL离心管中，800 g×5 min 4 °C离心，吸出培养基，加入2 mL 4 °C预冷PBS重悬细胞后再次800 g×10 min 4 °C离心，尽量吸干PBS，加入裂解液冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 B. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起12000 g×5 min 4 °C离心，取上清于1.5 mL 离心管中并置于- 20 °C保存或进行下一步。 3) 组织中总蛋白的提取 A. 将组织块尽量剪碎，加入含PMSF的裂解液于匀浆器中，进行匀浆然后置于冰上。 B. 几分钟后，再次匀浆，置于冰上。如此反复几次使组织尽量碾碎。 C. 裂解30 min 后，将裂解液移至1.5 mL EP管 中，12000 g×5 min 4 °C离心，取上清于1.5 mL离心管中并置于- 20 °C保存或进行下一步。 2. 蛋白质定量：预测时长：1.5 h 一般选择BCA或者Bradford方法，具体方法见各试剂盒说明书。BCA要求检测波长为 562 nm，Bradford为595 nm。为避免假阳性结果，建议先把lysis buffer加入BCA工作液或考马斯G250混合看是否产生颜色。具体测完蛋白含量后，计算含50~100 ug蛋白的溶液体积即为上样量（一般8 cm宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为150 ug）。 1) 制作标准曲线 A. 从-20 °C取出1 mg/mL BSA，室温融化后，备用。 B. 取18个1.5 mL离心管，3个一组，分别标记为 0 μg，2.5 μg，5 μg，10 μg，20 μg，40 μg。 C. 按下表在各管中加入各种试剂。  混匀后，室温放置2 min。在生物分光光度计上比色分析。 2) 检测样品蛋白含量 A. 取足量的1.5 mL离心管，每管加入4 °C储存的考马斯亮蓝溶液1 mL。室温放置 30 min后即可用于测蛋白。 B. 取一管考马斯亮蓝加0.15 M NaCl 100 μL，混匀放置2 min可作为空白样品，将空白倒入比色皿中做好的标准曲线程序下按Blank测空白样品。 C. 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色皿2次，用无菌水洗一次。 D. 取一管考马斯亮蓝加95 μL 0.15 M NaCl溶液和5 μL待测蛋白样品，混匀后静置2 min后测量。 3. SDS-PAGE电泳 预计时长：1 h 取50 μg/孔蛋白上样电泳（上样总体积一般不超过15 μL）。 4. 转膜 预计时长：3 h 1) 在电泳结束前20 min开始准备转膜所需的东西。转一张膜需准备6张的滤纸（长一般为8.1~8.3 cm×宽8 cm）和1张NC或PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF膜使用前用无水甲醇中浸泡1 min~2 min，NC膜不需要。目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。 2) 将玻璃板撬开后，轻轻刮去浓缩胶，用蒸馏水冲洗干净。取出凝胶后可以在右上角裁一个小角以区分上下左右。之后有两种方法供选择，一是按照marker指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜。 3) 在陶瓷盆中倒入TB buffer，放入浸过甲醇的PVDF膜平衡10 min。带上手套，将夹子打开使黑的一面平放转移槽的底座，依次在石墨电极上垫一张海绵垫、叠放3张浸泡过缓冲液的滤纸、刚刚完成电泳的凝胶、PVDF膜（此时可在膜右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、和另外3张浸泡过缓冲液的滤纸、另一个海绵垫，合起夹子。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡，膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。 4) 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，所以TB Buffer要在4 °C预冷，转移槽要放在冰水混合泡沫箱中。的一边放一块冰来降温。一般用60 V 转移2 h或200 mA转1.5 h。 5) 转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇，可回收）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。使用预染marker话可以看见marker的颜色转印到了膜上，但是凭借这个颜色来判断是否转印完全或转印过头是不可靠的。 5. 免疫杂交反应 预计时长：1 Day 1) 封闭：将膜用TBST浸湿，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。 关键步骤：注意封闭后不要洗脱，（如果是自己配置的封闭液，最好过滤一下以消除固体杂质）。 2) 一抗孵育： 将一抗用封闭液稀释（一般用封闭液稀释即可，如果背景不高用TBST稀释也可以）至适当浓度（可以在5 mL EP管中配置工作液，常用稀释倍数为1：1000，具体按抗体说明来，用后可回收重复用，-20 °C保存，避免反复冻融）。 3) 脱色摇床上洗5 min×5次。 4) 二抗孵育：方法同一抗孵育，但一般二抗稀释比较大1：10000 足够。用TBST在室温下脱色摇床上洗4次，每次5 min。 二抗孵育有两种方法： A. 膜孵：撕下适当大小的一块儿封口膜（也可使用保鲜膜）铺于培养皿盖上，使封口膜保持平整，将抗体溶液加到封口膜上，从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡，放于湿盒中，室温孵育1 h或4 °C过夜孵育。用TBST在室温下脱色摇床上洗6×5 min。 B. 配制5 mL抗体稀释液于5 mL EP管中，直接将膜放入，4 °C过夜孵育，用TBST在室温下脱色摇床上洗4×5 min。 6. 化学发光 预计时长：10 min 化学发光反应：在实验台上铺一张一次性手套，将转移膜放在手套上，蛋白面向上。将化学发光的A液和B液两种试剂在EP管内等体积混合（总体积能够覆盖住膜就行，注意吸完A液后吸B液要换枪头，否则整瓶试剂都将报废），然后均匀滴在PVDF膜的蛋白面，反应1~2 min后（无需避光），将PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，凝胶图象分析或X-光片曝光。 7. X-光片曝光 预计时长：0.5 h 1) 将转移膜放在保鲜膜上，把另一侧翻过来盖在其上，把保鲜膜固定在片夹上。 2) 在暗室中，将配好的显影液和定影液倒入塑料盆中，打开红色照明灯，取出X光片，剪成比膜稍大，叠放3~4层后放在膜上，不要再移动X光片，关上X片夹，计时2~5 min。（多层胶片的目的是找到最合适的曝光度） 3) 时间完成后，打开片夹，X光片放入显影液，出现明显条带后停止显影，放入定影液， 4) 定影5~10 min至胶片透明。 5) 用水将胶片冲干净，晾干，观察结果。定影液和显影液可回收，避光室温放存，但不宜放太久。 关键步骤： 发光液的A、B液一定不能相互污染，吸取时一定要注意换枪头。配制好后应立即使用。 暗室中光线很弱，可暗适应一段时间在开始实验，拿胶片的时候避免用指甲滑到，会有划痕。 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。 2. 转膜时要把气泡赶走，PVDF膜不能剪的过小，否则空气容易从膜边缘进去，使得蛋白条带晕开。 3. 如果封闭液和抗体稀释液都含5%的脱脂奶粉，封闭之后不用TBST洗，如果封闭液含有而抗体稀释液不用，封闭后可用TBST清洗。 |
