目前，蛋白质电泳分离通常采用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质。蛋白质在电场力的牵引下，在凝胶形成的孔径内进行迁移。凝胶浓度越高，孔径越小。凝胶孔径的大小与蛋白质大小、电荷以及形状相结合，最终决定了蛋白质的迁移速度。

根据凝胶中是否加入蛋白变性剂，蛋白电泳可分为变性电泳和非变性电泳。变性电泳（常添加有0.1%的SDS）可用来估计多肽或蛋白质的纯度和分子量，而非变性电泳（常添加有2-巯基乙醇或二硫苏糖醇等还原剂）则可用来确定蛋白质的亚基数目和大小。非变性电泳可用来检测和分离“天然”状态的蛋白  。

材料（MATERIALS）

试剂（REAGENTS）

预制梯度胶、超纯水、SDS-loading buffer、考马斯亮蓝G250染液等

器械（EQUIPMENT）

电泳仪、电源、电泳槽等

实验步骤（PROCEDURE）

1. 根据计划跑胶的样品数量计算所需要的胶孔数目，选择合适样品孔的凝胶（节约原则），装在电泳仪中。胶板由一长一短两块儿板组成，短的那块朝里侧放置。

2. 将跑胶缓冲液倒在电泳槽中，液面恰好在两种高度的胶板之间。

3. 上样：提前煮好的蛋白样品，用白色的小枪头缓缓加入凝胶上样孔中。样品加入体积一般在5~7 μl 左右，如果样品较浓时3 μl 足矣。如果上样量太大，会降低电泳分辨率。

4. 电泳：盖上电泳仪上盖，150 V电压运行48 min（如果着急看结果，可以200 V电压电泳24~30 min）。

5. 染色：将胶板取出，用自来水将表面的气泡冲掉，用拆胶板把玻璃板撬开，将含有胶的玻璃板直接放在盛有自来水的染盒中，凝胶顺水冲落至染盒。

将染盒至于微波炉内，高火将水煮沸2分钟。此步骤的目的是将胶上的SDS煮掉，因为SDS 可以与考马斯亮蓝竞争性地与丙烯酰胺结合。重复1 次，尽量把SDS 洗干净。

加入G250 染液，在微波炉高火煮3分钟，将染液倒至染液回收缸中。用自来水将胶上的浮色洗净，加自来水煮沸至少3 次，直到背景很浅为止。

6. 拍照：使用白光投射或者白光反射，根据实际情况调节光圈与曝光时间。一般光圈用3，曝光时间在30+ ms 左右。照胶仪拍摄的照片是黑白的，因此也可以用自己的手机进行拍照，效果更好。

7. 清理：煮胶间隙，把所用的凝胶系统清洗干净并放置于本实验室规定放置的地方，清理实验台面。

针对性建议（TROUBLESHOOTING）

如果需要检测的蛋白很大（超过100 kDa）时，如做crosslinking 实验时往往会遇到这种情况，需要用4~12%梯度胶，尽量让大分子量的组分分开。样品浓度过高时，建议稀释样品制样。一定注意电极的正确插入。